建设工程施工过程中工程量增加的确认依据
河南四建股份有限公司与河南省智信爆破工程技术有限公司建设工程合同纠纷上诉案分析
一、本案要旨
本案要旨为，建设工程施工过程中，承包方是否实际增加了工程量，应当以发包方与承包方在履行合同过程中是否对工程进行了变更及最终双方对工程量的确认为依据，若发包方的施工现场负责人出具书面证明工程增加量属实，则发包方不得以业主未予确认而否定承包方施工过程中实际增加的工程量，应当支付相应增加的工程款项。
2008年3月10日，方城风电公司将南阳方城23.25MW电场工程发包给河南检修公司，2008年3月，河南检修公司将该工程全部转包给河南四建公司，河南四建公司将该工程交给河南四建南阳分公司承建，河南四建南阳分公司项目部经理为沈建军。河南四建南阳分公司将部分工程交于河南爆破公司施工，河南爆破公司项目部经理为杜道永。2008年4月23日，河南爆破公司与河南四建南阳分公司签订了爆破工程合同，2008年7月26日工程竣工。2008年7月26日，河南四建公司项目部经理沈建军给河南爆破公司项目部经理杜道永出具凭据一张：“杜道永施工队1020一1940B线段及所属内的工程已结束，沈建军，2008．7．26日”。2008年11月28日，河南四建公司方城风力发电项目部经理沈建军给河南智信爆破公司项目部经理杜道永出具工作量确认书一份，内容为：二标段1—5风机建筑施工中，由于实际需要，将道路向山体内移动：另外，设计自然高程与实际高程之间也有较大误差，造成工作量增加如下：石方爆破19873立方米，路面碎石铺填4692平方米。沈建军签字。2008．11．28日。
本案的争议焦点主要为，河南爆破公司在诉讼中主张增加工程量款815250.10元的问题。
一审法院审理认为，河南爆破公司请求河南四建公司支付合同外所增加部分工程量的工程款815250．10元，根据实际施工的工程量及合同约定的计算方法，经计算后得出其增加部分工程量的工程款为815250.10元。因其现场增加部分的工程量已经得到沈建军的签字认可，该增加部分工程量的工程款应予确认，因此，河南爆破公司要求河南四建公司支付该增加部分工程量的工程款的诉讼请求，符合法律规定，予以支持。河南四建南阳分公司抗辩需要由业主确认的理由，原审法院认为，根据查明的案件事实，河南爆破公司确实已根据河南四建南阳分公司的要求，实际进行了施工，增加了工程量，不能因为业主未予确认而否定原告施工过程中实际增加的工程量，但对于增加部分工程量的工程款，根据双方签订的“爆破工程合同”的约定，单价应以业主发包价的百分之九十计算。根据合同相对性原则，河南四建南阳分公司应当对增加部分工程量的工程款承担清偿责任。关于沈建军本人称其签订的工作量确认书是受到河南爆破公司项目部经理杜道永胁迫签订的理由，原审法院认为，在整个诉讼过程中，沈建军本人、河南四建公司及其南阳分公司，均未提供证据予以证实，故对沈建军本人所述的理由，不予采纳。
二审法院审理认为，依据合同相对性原则，该争议增加的工程量是否真实，在于河南四建南阳分公司与河南爆破公司在履行合同中是否对工程进行了变更及最终双方对工程量的确认为依据。2008年7月6日工程竣工后，河南四建公司方城风力发电项目部经理沈建军以书面形式确认河南爆破公司所属合同内的工程结束，尔后，又于2008年11月28日，又给河南爆破公司出具工作量确认书一份，并说明由于实际需要，将道路向山体内移动，另外，设计自然高程与实际高程之间也有较大误差，造成工程量增加如下，石方爆破开挖19873立方米，路面碎石铺填4692平方米，虽然沈建军在庭审中抗辩该工作量确认书属受胁迫所致，但没有举证受胁迫的有关证据，且在此之后也未采取相应措施予以补救，现河南爆破公司依此主张权利时，抗辩受胁迫所致的理由缺乏证据支持。据此，河南爆破公司主张增加工程量请求，理由正当，原审法院支持该请求正确，法院予以维持。
二、案件来源
南阳市卧龙区人民法院（2010）南管民终字第41号；河南省南阳市中级人民法院(2011)南民商终字第111号
三、基本案情
2008年3月10日，方城风电公司将南阳方城23.25MW电场工程发包给河南检修公司，工程总价款为合同价8990000元，该价格为河南检修公司完成合同所要求的所有工作的全部价格，在合同有效期内，综合单价保持不变。该合同约定不得转包。河南检修公司是承包人，其项目部经理先后为杨建林、李建支。2008年3月，河南检修公司将该工程全部转包给河南四建公司，其工程名称、工程承包范围及工作内容与方城风电公司、河南检修公司签订的施工合同完全相同，其合同价款暂定总价为842OOOO元。该价格为河南四建公司完成合同所要求的所有工作的全部价格(不含建筑营业税)，如无调整，在合同有效期内保持固定不变。该合同约定不得分包。河南四建公司将该工程交给河南四建南阳分公司承建，河南四建南阳分公司项目部经理为沈建军。河南四建南阳分公司将部分工程交于河南爆破公司施工，河南爆破公司项目部经理为杜道永。2008年4月23日，河南爆破公司与河南四建南阳分公司签订了爆破工程合同，该合同约定：“甲方：河南四建股份有限公司方城风电项目部，乙方：河南智信爆破工程技术有限公司，根据甲方所承包的中电投方城风电厂二标段施工要求，需对二标段风机基础，路基的山体实施爆破开挖和修筑。经过招标决定，由河南智信爆破工程技术有限公司对部分工程实施爆破开挖，为确保安全、质量、进度，明确双方责任，遵照《中华人民共和国经济合同法》、《矿山开采安全施工条例》甲、乙双方在平等互利的基础上，制定本合同，双方共同遵守，条款如下：一、工程内容，对中电投方城风电厂二标段部分风机基础，路基基础实施爆破开挖和修筑。其中包括如下内容：山体爆破、石方开挖、路面的平整清理、修坡、边沟、局部护理基础，路基碎石层铺设压实：风机基础、安装平台爆破清理及平整、铺设碎石层，最终达到甲方要求。二、工程地点：方城县二郎庙乡后林村。三、承包方式：保安全、保质量、保工期、包工人、包材料、包机械、工期从2008年3月15日开始。四、工程造价(人民币)：石方爆破每立方22元，34000立方米，748000元；土石方圆填每立方米18元，9461立方米，170298元；边沟爆破每米35元，919米，32165元；路面碎石铺填每平方米18元，10392平方米，187056元；安装平台碎石铺填每平方米40元，3711平方米，148450元。合同总额1285969元。五、工程量变更，现场增加工作，其工程量以业主认可量为准，单价以业主发包价的90％计算。六、付款办法：第一次完成工程量1万立方米结算，以后每完成1.5万立方米结算一次。工程竣工后，经业主、监理验收合格后付完最后工程款。……甲方沈建军签字(加盖河南四建股份有限公司南阳分公司方城风力发电项目部公章)，乙方河南智信爆破工程有限公司杜道永签字。”合同签订后，河南爆破公司即按照合同的约定开始施工，施工段为KBl02O—KB1940。该工程中护坡和边沟系河南四建南阳分公司施工，其余施工项目均为河南爆破公司施工。2008年7月26日工程竣工。2008年7月26日，河南四建公司项目部经理沈建军给河南爆破公司项目部经理杜道永出具凭据一张：“杜道永施工队1020一1940B线段及所属内的工程已结束，沈建军，2008．7．26日”。2008年11月28日，河南四建公司方城风力发电项目部经理沈建军给河南智信爆破公司项目部经理杜道永出具工作量确认书一份，内容为：二标段1—5风机建筑施工中，由于实际需要，将道路向山体内移动：另外，设计自然高程与实际高程之间也有较大误差，造成工作量增加如下：石方爆破19873立方米，路面碎石铺填4692平方米。沈建军签字。2008．11．28日。2008年12月21日，沈建军向河南爆破公司出具一份委托书：“中电投河南电力检修工程有限公司：今委托贵公司将我公司方城风电项目部工程款代付给智信爆破有限公司杜道永工程队，代付金额按我公司与智信爆破有限公司杜道永工程队签订合同款额(已支付肆拾肆万元整)。由此产生的一切问题由我公司承担。沈建军(加盖河南四建股份有限公司南阳分公司方城风力发电项目部公章)，2008年12月21日”。随后，河南智信爆破公司持该委托书追要工程款未果，双方发生纠纷，河南智信爆破公司诉至原审法院。
整个工程的工程款支付情况为：方城风电公司将南阳方城23.25MW电场工程承包给河南检修公司的总价款为8990000元，且该价格为不变价格。截止2010年11月26日，方城风电公司仅支付河南检修公司工程款7130000元，余款1860000元，尚未支付。河南检修公司将全部工程转包给河南四建公司的合同价款为8420000元，截止2010年11月26日，河南检修公司仅支付给河南四建公司工程款6813595.28元，余款1606404.72元，尚未支付。河南四建南阳分公司付款给河南爆破公司570000元。
经河南兴河造价咨询有限公司对河南四建公司所承建的23.25MW风电场1#一12#风机及场内道路工程的审计，河南兴河造价咨询有限公司出具基建施工预决(结)算审核验证定案表。2010年11月29日，河南四建南阳分公司项目部经理沈建军在该表上签字确认。随后，河南检修公司项目部经理李建支也予以签字确认，并得到方城风电公司的认可。该决算表显示：预算金额为7788666.62元，审减金额为60024.74元，定案金额为7728641.87元。取消项目为：碎石铺填，工程款为36748.60元；2、现浇混凝土钢筋工程款为114612.83元：3、级配碎石底基层(厚200MM)，工程款为594598.70元：4、泥结碎石路面(厚200MM)，工程款为583637.51元。以上工程款共计1329597.08元。其他工程项目经河南兴河造价咨询有限公司审核，核减情况为：1、扣除石砌体中小毛石材料价格项目扣减为56435.71元；2、风机基础挖土方项目扣减4.08元；3、风机基础挖石方项目扣减为40.21元；4、箱变基础挖土方项目扣减为1.48元；5、箱变基础挖石方项目扣减为0.77元；6、混凝土垫层项目扣减为231.82元；7、混凝土垫层项目扣减100.14元；8、砖基础项目扣减1550.49元；9、利用土石回填项目扣减650.59元；10、风机基础及箱变基础接地项目扣减10090.45元。以上共计扣减60024.74元。
另查明，河南四建南阳分公司系河南四建股份有限公司在南阳依法设立的分支机构，无独立法人资格。方城风电公司23.25MW风电场1#一l2#风机及场内道路工程已于2009年1月22日投入使用。
四、法院审理
原审法院认为：一、关于河南四建公司及其南阳分公司是否承担民事清偿责任的问题。《中华人民共和国建筑法》第二十八条规定：“禁止承包单位将其承包的全部建筑工程转包给他人，禁止承包单位将其承包的全部建筑工程肢解以后以分包的名义分别转包给他人。”，且方城风电公司与河南检修公司签订的施工合同中明确约定不得转包，河南检修公司与河南四建公司签订的施工合同中也明确约定不得分包，因此，河南检修公司将该工程转包给河南四建公司的合同无效；河南四建南阳分公司将部分工程分包给河南爆破公司的合同也属无效。因该工程方城风电公司已投入使用，故河南四建南阳分公司应当按照河南爆破公司的实际工作量及双方约定的计算方法向河南爆破公司支付工程款。河南四建南阳分公司是河南四建公司在南阳依法设立的分公司，根据《中华人民共和国公司法》第十四条的规定，分公司不具有法人资格，其民事责任由公司承担，因此，河南四建南阳分公司的行为而产生的民事责任应当由河南四建公司承担。河南爆破公司请求河南四建南阳分公司承担民事清偿责任的诉讼请求，不予支持。河南爆破公司要求河南四建公司支付该合同约定内的工程款1285969元，河南四建公司已付570000元，下欠715969元，符合法律规定，予以支持。河南爆破公司请求河南四建公司支付合同外所增加部分工程量的工程款815250．10元，根据实际施工的工程量及合同约定的计算方法，经计算后得出其增加部分工程量的工程款为815250.10元。因其现场增加部分的工程量已经得到沈建军的签字认可，该增加部分工程量的工程款应予确认，因此，河南爆破公司要求河南四建公司支付该增加部分工程量的工程款的诉讼请求，符合法律规定，予以支持。河南四建公司抗辩河南爆破公司完成的工程量与合同的约定不符的理由，由于河南四建公司及南阳分公司均未能提供相关证据予以证实，故对其抗辫理由不予采信。河南四建南阳分公司抗辩需要由业主确认的理由，原审法院认为，根据查明的案件事实，河南爆破公司确实已根据河南四建南阳分公司的要求，实际进行了施工，增加了工程量，不能因为业主未予确认而否定原告施工过程中实际增加的工程量，但对于增加部分工程量的工程款，根据双方签订的“爆破工程合同”的约定，单价应以业主发包价的百分之九十计算。根据合同相对性原则，河南四建南阳分公司应当对增加部分工程量的工程款承担清偿责任。关于沈建军本人称其签订的工作量确认书是受到河南爆破公司项目部经理杜道永胁迫签订的理由，原审法院认为，在整个诉讼过程中，沈建军本人、河南四建公司及其南阳分公司，均未提供证据予以证实，故对沈建军本人所述的理由，不予采纳。
二、关于方城风电公司委托河南兴河造价咨询有公司审计的决算中关于取消项目和核减项目的结论是否对河南爆破公司有约束力的问题。原审法院认为，方城风电项目是国家投资建设工程，按照有关规定，在工程完工后应当对该工程进行决算并予以审计。该决算表是在河南兴河造价咨询有限公司，河南四建南阳分公司项目经理沈建军和河南检修公司项目经理李建支参加下做出的，对于方城风电公司、河南四建公司及其分公司、河南检修公司具有约束力。但是，合同具有相对性，河南四建公司南阳分公司与河南爆破公司签订的合同决定了河南四建公司南阳分公司与河南爆破公司之间的权利义务关系，双方应按照该合同的约定处理双方的纠纷。故该决算审计对河南爆破公司无约束力。
三、关于方城风电公司是否承担民事责任的问题。方城计电公司作为南阳方城23.25MW电场工程的业主，将该工程发包河南检修公司，河南检修公司将该工程转包给河南四建公司，河南四建公司将该工程交给河南四建南阳分公司承建，河南四建南阳分公司又将该工程中的部分工程承包给河南爆破公司施工，河南爆破公司是该部分工程的实际施工人，予以确认。《最高人民法院关于审理建设工程施工合同纠纷案件适用法律问题的解释》第二十六条第二款规定：“实际施工人以发包人为被告主张权利的，人民法院可以追加转包人或者违法分包人为本案当事人。发包人只在欠付工程价款范围内对实际施工人承担责任。”，因此，方城风电公司应在欠付工程价款范围内对河南爆破公司承担责任。
四、关于河南检修公司是否承担连带清偿责任的问题。河南检修公司以总价款8990000的价格承建南阳方城23．25MW电场工程后，将全部工程以8420000元的价款转包给河南四建公司，但保留了对工程的管理权和工程款的结算权，因此，在工程施工及工程款结算中，河南检修公司行使着发包人的权利，应当与发包人即方城风电公司承担相同的民事责任，故河南检修公司应在欠付工程价款范围内对河南爆破公司承担责任。河南爆破公司请求河南检修公司承担连带清偿责任的诉讼请求，不予支持。判决：一、被告河南四建股份有限公司在本判决生效后十日内给付原告河南省智信爆破工程技术有限公司工程款1531219.10元，并自2008年7月26日起按照中国人民银行公布的同期贷款利率计息至款付清之日。二、被告中电投河南电力检修工程有限公司、第三人中电投南阳方城风力发电有限公司在欠付工程款的范围内对原告河南省智信爆破工程技术有限公司承担责任。三、驳回原告河南省智信爆破工程技术有限公司的其他诉讼请求。
二审法院认为：1、依据《中华人民共和国建筑法》第二十八条的规定，原审法院判令河南检修公司与河南四建公司；河南四建公司南阳分公司与河南爆破公司之间签订的建设工程合同均为无效合同，符合法律规定，本院予以维持。2、河南四建公司、河南四建南阳分公司、河南爆破公司对合同内应支付的款项1285969元均无异议，本院予以认可。3、本案所争主要是河南爆破公司在诉讼中主张增加工程量款815250.10元的问题：依据合同相对性原则，该争议增加的工程量是否真实，在于河南四建南阳分公司与河南爆破公司在履行合同中是否对工程进行了变更及最终双方对工程量的确认为依据。2008年7月6日工程竣工后，河南四建公司方城风力发电项目部经理沈建军以书面形式确认河南爆破公司所属合同内的工程结束，尔后，又于2008年11月28日，又给河南爆破公司出具工作量确认书一份，并说明由于实际需要，将道路向山体内移动，另外，设计自然高程与实际高程之间也有较大误差，造成工程量增加如下，石方爆破开挖19873立方米，路面碎石铺填4692平方米，虽然沈建军在庭审中抗辩该工作量确认书属受胁迫所致，但没有举证受胁迫的有关证据，且在此之后也未采取相应措施予以补救，现河南爆破公司依此主张权利时，抗辩受胁迫所致的理由缺乏证据支持。据此，河南爆破公司主张增加工程量请求，理由正当，原审法院支持该请求正确，本院予以维持。河南检修公司，方城风电公司在本案所诉中不是合同相对人，原审法院依据《最高人民法院关于审理建设工程施工合同纠纷案件适用法律问题的解释》第二十六条第二款的规定，判令河南检修公司，方城风电公司在欠付工程款范围内对河南爆破公司承担责任，符合法律规定，本院予以维持。河南四建公司上诉称，河南检修公司、方城风电公司应对河南爆破公司承担连带责任的理由，与法无据，本院不予采纳。综上，原审判决事实清楚，证据充分，适用法律正确，处理适当，依据《中华人民共和国民事诉讼法》第一百五十三条第一款之规定，判决如下：
驳回上诉，维持原判。
本判决为终审判决。
五、与本案及类似案例相关的法规索引
《最高人民法院关于审理建设工程施工合同纠纷案件适用法律问题的解释》
第二十六条 实际施工人以转包人、违法分包人为被告起诉的，人民法院应当依法受理。
实际施工人以发包人为被告主张权利的，人民法院可以追加转包人或者违法分包人为本案当事人。发包人只在欠付工程价款范围内对实际施工人承担责任。
《建设工程价款结算暂行办法》
第十条工程设计变更价款调整
（一）施工中发生工程变更，承包人按照经发包人认可的变更设计文件，进行变更施工，其中，政府投资项目重大变更，需按基本建设程序报批后方可施工。
（二）在工程设计变更确定后14天内，设计变更涉及工程价款调整的，由承包人向发包人提出，经发包人审核同意后调整合同价款。变更合同价款按下列方法进行：
1、合同中已有适用于变更工程的价格，按合同已有的价格变更合同价款；
2、合同中只有类似于变更工程的价格，可以参照类似价格变更合同价款；
3、合同中没有适用或类似于变更工程的价格，由承包人或发包人提出适当的变更价格，经对方确认后执行。如双方不能达成一致的，双方可提请工程所在地工程造价管理机构进行咨询或按合同约定的争议或纠纷解决程序办理。
（三）工程设计变更确定后14天内，如承包人未提出变更工程价款报告，则发包人可根据所掌握的资料决定是否调整合同价款和调整的具体金额。重大工程变更涉及工程价款变更报告和确认的时限由发承包双方协商确定。
收到变更工程价款报告一方，应在收到之日起14天内予以确认或提出协商意见，自变更工程价款报告送达之日起14天内，对方未确认也未提出协商意见时，视为变更工程价款报告已被确认。
确认增（减）的工程变更价款作为追加（减）合同价款与工程进度款同期支付。
（本文为原创作品，未经作者书面授权，禁止转载）
编者注：本文摘自北京建设工程与房地产专业律师唐湘凌编著的《中国建设工程施工合同纠纷案例百案评析》。唐湘凌毕业于中国人民大学，法学硕士，从事法律职业十余年。其北京建设工程与房地产专业律师团队处理过大量涉及工程建设、房地产的法律事务，在该领域有丰富经验，欢迎委托处理该领域的法律事务（地址：北京市朝阳区东三环北路38号北京国际中心；电话：186-0190-0636，邮箱：lawyernew@163.com）。
关于进境鸵鸟检疫有关问题的通知
动植物检疫局
关于进境鸵鸟检疫有关问题的通知
（动植检动字〔１９９６〕８７号）
各直属口岸动植物检疫局、动物检疫所：
近年来，鸵鸟的引进和繁养在我国呈现了迅猛发展的势头，为满足引进鸵鸟及其种蛋的需要，一年多来，我们先后与美国、加拿大、法国、荷兰、津巴布韦、博茨瓦那、澳大利亚和纳米比亚签署了进境鸵鸟的检疫和卫生条件议定书，从而为引进鸵鸟在检疫方面铺平了道路。随着鸵鸟的大量引进，我们的检疫工作也日趋繁重，而鸵鸟的检疫在我国还是个崭新的课题，为总结近年来进境鸵鸟的检疫经验，进一步提高检疫水平，防止疫病随进口鸵鸟及其种蛋传入我国，使鸵鸟的检疫工作更加规范化和标准化，保证进境鸵鸟检疫工作的顺利进行，现就进境鸵鸟及其种蛋入境后的检疫工作的有关问题通知如下：
一、进境鸵鸟检疫
1．鸵鸟入境后须在口岸动植物检疫局指定的隔离场所进行为期45天的隔离检疫
，如须延长隔离检疫时间，须报国家局批准。
2．鸵鸟运抵隔离场一周后，逐只进行采血采样，并分成两份，其中一份保存备
查，并注意编号。
3．隔离检疫期间的实验室检疫项目，主要依照我国与输出国缔结的鸵鸟检疫议
定书规定的实验室检疫项目进行。如发生特种情况可做特殊检疫项目。
4．实验室检疫的操作试行程序附后。
二、进境鸵鸟种蛋检疫
1．进境种蛋的孵化厂须获得口岸动植物检疫机关的认可。
2．进境鸵鸟种蛋在入孵前，须用有效的消毒药进行熏蒸处理。
3．进境种蛋不得与其他种蛋一同孵化。
4．首次孵出的小鸟须在口岸动植物检疫机关认可的场所由口岸检疫机关隔离检
疫30天，在此期间采样并依照我国与输出国缔结的鸵鸟种蛋的检疫议定书规定的项目作实验室检疫。
三、其他未尽事宜按《进境动物检疫管理办法》执行。
四、在执行过程中有何问题，请及时上报国家局。
附件：鸵鸟疫病实验室检疫操作试行规程
中华人民共和国动植物检疫局
一九九六年八月二十六日
鸵鸟沙门氏菌泄殖腔拭子培养规程（试行）
一、材料：
灭菌棉拭子、缓冲蛋白胨水、亚硒盐胱氨酸增菌液、胆硫乳琼脂、三糖铁琼脂、生化试验管、多价血清因子、细菌培养必需设备。
二、操作方法：用无菌棉拭子从泄殖腔取样，放无菌瓶中，尽可能冷藏于2～4℃，编号后送实验室检验。
三、实验室检验：
┌────────┐
│ 棉拭子样品 │
└─┬──────┘
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┌─────┴─────┐
│ 缓冲蛋白胨水 │
└───┬───────┘
３７℃ │１８￣２４hr
┌──┴───────┐
│ 亚硒盐胱胺酸增菌液 │
└─┬────────┘
３７℃│ １８￣２４hr
│
┌───┴───┐
│ ＤＨＬ培养基 ├────────────────┐
└─┬─────┘ │
┌──┴───────┐ ┌──┴────┐
│挑取可疑菌落划线接种│ │ 可疑菌落 │
└────┬─────┘ └──┬────┘
│ │
┌───┴────┐ │
│ 三糖铁培养基 │ │
└──┬─────┘ ┌────┴──────┐
│ │ 革兰氏染色，镜检 │
３７℃ │ １８￣２４hr │ │
│ └────────┬──┘
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┌─┤细菌鉴定├───┐ │
│ └────┘ │ │
│ │ │
┌┴───┐ ┌─┴──────┐ │
│生化试验│ │ 血清学试验 │ │
└─┬──┘ └┬───────┘ │
│ ┌┴─────┐ │
└───────┤综合判定结果├─────────────┘
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┌─┴────────┐
│ 试验结果报告 │
└──────────┘
鸵鸟鹦鹉热间接血凝（IHA）操作规程（试行）
一、本规程适用于鸵鸟衣原体病的诊断。
二、材料
衣原体属抗原致敏绵羊红细胞
标准阴、阳性对照血清
被检血清：采集鸵鸟血清，试验前于56℃水浴灭活30分钟。
90度V型反应板
灭菌生理盐水
微量加样器
三、试验方法
1．将生理盐水滴于V型反应板中，每孔50ul。
2．取被检血清50ul于第一孔中，与生理盐水混匀后吸50ul于第二孔，依次作倍
比稀释至1∶16。
3．将1∶8和1∶16两孔各加25ul抗原，如作定量试验可根据实际需要自行决定。
4．对照试验：设阳性血清＋抗原、阴性血清＋抗原、生理盐水＋抗原各一孔。
四、血凝反应程度的标准：
“＋＋＋＋”：红细胞全部凝集，形成一层均匀的膜，布满整个孔底。
“＋＋＋”：红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者稍小。
“＋＋”：红细胞在孔底形成薄层凝集，边缘松散或呈锯齿状。
“＋”：红细胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圆点。
“＋”：红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑。
“—”：红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点。
“＋＋”以上的凝集判为阳性凝集。
五、结果判定
1．对照试验：出现如下结果试验方可成立，否则应重试，阳性血清＋抗原呈“
＋＋＋＋”；阴性血清十抗原呈“-”；抗原十生理盐水
2．被检样品判定标准：血清效价＞1∶8（＋＋）判为阳性。
鸵鸟新城疫、禽流感、付粘病毒分离操作规程（试行）
本规程适用于新城疫、禽流感、付粘病毒的分离
一、材料
1．消毒棉拭子
2．灭菌试管
3．灭菌生理盐水
4．泄殖腔棉拭子保存液：PBS，PH7．2-7.4，青霉素1万单位／ml，链霉素10mg/m1，庆大霉素250ug/ml，制霉素5000u／ml。
5．SPF种蛋。
6．90度V型反应板。
7．微量加样器。
二、操作方法
1．将采集的泄殖腔棉拭子置于样品保存液中，置4℃过夜。次日3000rpm离心10min，上清液作菌检后接种9～10日龄鸡胚（每胚0．2ml），37℃再孵育5天，去掉24小时死亡的鸡胚，其他鸡胚放4℃冷却后，检测鸡胚尿囊液的血凝滴度。如尿囊液
的血凝反应呈阴性，应再用鸡胚盲传2代。
2．将收集的尿囊液用PBS以25ul量进行倍比稀释，加25ul的1％鸡红细胞，轻轻
混匀，静置15～30min，判定血凝滴度。
如鸡胚尿囊液的血凝试验呈阳性，应分别用新城疫病毒、禽流感病毒、副粘病毒的阳性血清作血凝抑制试验以检测病毒的种类。
表一 鸡胚尿囊液血凝试验 （单位：ul）
┌─────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬───┬────┐
│ 孔号 │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │ 10 │ 11│ 12 │
├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤
│抗原稀释度│ 1∶2 │ 1∶4 │ 1∶8 │1∶16 │1∶32 │ 1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 1∶512│1∶1024 │对照 │对照 │
├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤
│ 生理盐水│ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 50│ 50 │
├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤
│ 抗原 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ │ │
├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤
│1％红细胞 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25│ 25 │
└─────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴───┴────┘
室温15min，每5mim观察一次
┌─────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬───┬────┐
│ 判定举例│++++ │++++ │++++ │+++ │ ++ │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ - │
└─────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴───┴────┘
禽流感血凝抑制试验操作程序（试行）
一、试验材料
1．抗原：禽流感病素H5、H7型抗原；
2．阴、阳性对照血清。
3．红细胞：无菌采集鸡血液5～10ml于少许阿氏液中摇匀，以洗涤3～5次，每次3000rpm离心10min，将血浆、白细胞充分洗去至上清液清亮，再将沉淀的红细胞稀释成1％的红细胞悬浮液（RBC）；
4．被检血清：采集被检鸵鸟血液，离心分离血清，56℃灭活30min；
5．稀释液：灭菌的生理盐水或PBS（pH7．2～7．4）
6．90度V型反应板，微量加样器。
二、试验操作
1．血凝试验（HA）：
取干净的微量滴定板（V型）一块，按表一进行操作：每孔加25ul生理盐水，孔
1加禽流感抗原25ul，用移液器反复吹打混匀三次；吸出25ul于孔2，吹打混匀后吸出25ul于孔3；如此依次稀释到孔10，孔10混匀后吸出25ul弃掉。孔11、12不加抗原
，只加生理盐水作空白对照。加入1％的红细胞悬浮液25ul，充分振荡后置于室温；
每5min观察一次，15～30min后判定结果，并作好记录。
表一 禽流感血凝试验 （单位：ul）
┌─────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐
│ 孔号 │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │ 10 │ 11│ 12│
├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤
│抗原稀释度│ 1∶2│ 1∶4│ 1∶8│1∶16 │1∶32 │1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 1∶512│1∶1024 │对照 │对照 │
├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤
│生理盐水 │ 25│ 25│ 25│ 25│ 25│ 25│ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 50│ 50│
├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤
│ 抗原 │ 25│ 25│ 25│ 25│ 25│ 25│ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ │ │
├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤
│1％红细胞 │ 25│ 25│ 25│ 25│ 25│ 25│ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25│ 25│
└─────┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘
室温15min，每5min观察一次
┌─────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐
│ 判定举例│ + │ + │ + │ + │ + │ + │ + │ - │ - │ - │ - │ - │
└─────┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘
抗原的血凝滴度是凡能使1％的鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数；因此，
能使红细胞完全凝集的最高稀释倍数的病毒液25ul称为1个血凝单位（HA）。如该抗
原的血凝单位为1∶128／25ul。
在进行禽流感血凝抑制试验时，病毒的工作浓度应为8HA。因为该试验的抗原的
血凝单位为1∶128／25ul，按其孔号数（孔．7）倒退3孔的稀释倍数（孔4 1∶16）
，作为该病毒的工作浓度：1∶16／25ul。
2．血凝抑制试验（HI）：
取干净的微量滴定板（V型）一块，按表二进行操作：每孔加25ul生理盐水，孔
1加待检血清25ul，用移液器反复吹打混匀三次；吸出25ul于孔2，吹打混匀后吸出25ul于孔3；如此依次稀释到孔8，孔8混匀后吸出25ul弃掉。孔9作为阳性血清对照，孔10作为阴性血清对照，孔11不加任何血清而作为抗原对照，孔12不加抗原和任何血清，只加PBS作空白对照。各孔加入1％的红细胞悬浮液25ul，充分振荡后置于室温；每5min观察一次，15～30min后判定结果，并作好记录。
未免疫的健康鸵鸟血清无血凝抑制作用，各稀释倍数均出现红细胞凝集现象；禽流感感染或免疫的鸵鸟血清能抑制禽流感病毒对红细胞的凝集作用。凡能使8HA的
抗原凝集红细胞作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价（如表二的血凝抑制价为1∶64）。
表二 禽流感血凝抑制试验 （单位：ul）
┌──────┬───┬───┬───┬────┬────┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐
│ 孔号 │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │ 10 │ 11│ 12│
├──────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤
│血清稀释度 │ 1∶2│ 1∶4│ 1∶8│ 1∶16 │ 1∶32 │1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 阳性 │ 阴性 │抗原 │对照 │
├──────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤
│ 生理盐水 │ 25│ 25│ 25│ 25 │ 25 │ 25│ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 50│ 75│
├──────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤
│ 被检血清 │ 25│ 25│ 25│ 25 │ 25 │ 25│ 25 │ 25 │ (25)│ (25)│ │ │
├──────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤
│ 8HA抗原 │ 25│ 25│ 25│ 25 │ 25 │ 25│ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25│ │
└──────┴───┴───┴───┴────┴────┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘
室温感作5～6min
┌──────┬───┬───┬───┬────┬────┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐
│ 1％红细胞 │ 25│ 25│ 25│ 25 │ 25 │ 25│ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 25│ 25│
└──────┴───┴───┴───┴────┴────┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘
室温15min，每5min观察一次
┌──────┬───┬───┬───┬────┬────┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐
│ 判定举例 │ - │ - │ - │ - │ - │ + │ + │ + │ + │ + │ + │ + │
└──────┴───┴───┴───┴────┴────┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘
3．判定标准
1）判定时应首先观察各对照孔是否完全符合；
2）红细胞凝集：红细胞分散在孔底四周呈均匀的颗粒状凝集且布满整个孔底，
判为血凝作用为阳性“十”；
3）无凝集或凝集抑制：红细胞集中于孔底中央呈点状，判血凝作用为阴性“—
”，或判血凝抑制作用为阳性；
4）血凝抑制价：凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制的最高血清稀释倍数；
5）被检血清的血凝抑制价在1∶8以上者，判为阳性反应；
6）最后判定时间与感作时间有关。温度高时感作时间短，15min即可；温度低时可适当延长，但最长不得超过30min。
禽流感琼脂扩散试验操作规程（试行）
1．琼脂凝胶平板的制备：称取琼脂糖1g，氯化钠8．5g，加入100ml蒸馏水，10磅10分钟高压溶解后，冷却至45℃，加入0．01％叠氮钠，每个直径6CM平皿加7ml融化琼脂，厚度为2．8mm，待凝固后置冰箱内片刻。
2．打孔：中间一孔，周围六孔为一组，孔径3mm，孔居2．5mm。
3．加样：中心孔加抗原，周围1、3、5孔加阳性血清，2、4、6孔加被检血清。
4．加样后置湿盒内，于室温下感作。
5．结果判定：24小时初判，48小时终判，阳性对照成立时，进行判定。
阳性：被检血清孔与抗原孔之间出现致密沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端互相联接。
可疑：标准阳性血清孔和抗原孔之间的沉淀线向被检血清孔内侧弯曲。
阴性：抗原孔与被检血清孔之间不出现沉淀线或标准阳性血清与阳性孔间的沉淀线向毗邻的被检血清孔直伸或其外侧偏弯。
禽副粘病毒血凝抑制试验操作程序
一、试验材料
1．抗原：禽副粘病毒病毒Ⅱ型抗原；
2．红细胞：无菌采集鸡血液5～10ml于少许阿氏液中摇匀，以洗涤3～5次，每次3000离心10min，将血浆、白细胞充分洗去至上清液清亮，再将沉淀的红细胞稀释
成1％的红细胞悬浮液（RBC）；
3．被检血清：采集被检鸵鸟血液，离心分离血清，56℃灭活30min；
4．稀释液：灭菌的生理盐水或PBS（pH7．2～7．4）
5．阴、阳性对照血清
6．90度V型反应板，微量加样器。
二、试验操作
1．血凝试验（HA）：
取干净的微量滴定板（V型）一块，按表一进行操作：每孔加25ul生理盐水，孔
1加禽流感抗原25ul，用移液器反复吹打混匀三次；吸出25ul于孔2，吹打混匀后吸出25ul于孔3；如此依次稀释到孔10，孔10混匀后吸出25ul弃掉。孔11、12不加抗原
，只加生理盐水作空白对照。加入1％的红细胞悬浮液25ul，充分振荡后置于室温；
每5min观察一次，15～30min后判定结果，并作好记录。
表一 禽副粘病毒血凝试验 （单位：ul）
┌──────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬────┬────┬────┬─────┬───┬───┐
│ 孔号 │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │ 10 │ 11│ 12│
├──────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼─────┼───┼───┤
│抗原稀释度 │ 1∶2│ 1∶4│ 1∶8│1∶16 │1∶32 │1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 1∶512│ 1∶1024 │对照 │对照 │
├──────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼─────┼───┼───┤
│ 生理盐水 │ 25│ 25│ 25│ 25│ 25│ 25│ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ 50│ 50│
├──────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼─────┼───┼───┤
│ 抗原 │ 25│ 25│ 25│ 25│ 25│ 25│ 25 │ 25 │ 25 │ 25 │ │ │
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